Identificación de compuestos inhibidores que se forman en el hidrolizado enzimático de celulosa y hemicelulosa presentes en cáscara de arroz.

Oyola Giler, Patricia Dolores

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Identificación de compuestos inhibidores que se forman en el hidrolizado enzimático de celulosa y hemicelulosa presentes en cáscara de arroz.

Oyola Giler, Patricia Dolores

URI: http://repositorio.utmachala.edu.ec/handle/48000/10074

Fecha: 2017

Resumen:

En el presente trabajo investigativo, se realizó una cuantificación de los compuestos inhibidores que se formaron en el hidrolizado enzimático de la celulosa y hemicelulosa presentes en la cáscara de arroz, también se procedió a realizar una caracterización físico-química y la determinación de compuestos inhibidores presentes en la cáscara de arroz, con la finalidad de saber si esta biomasa lignocelulósica contiene inicialmente compuestos inhibidores. Los compuestos inhibidores, retardan la velocidad de reacción de las enzimas hidrolasas, es por ello la importancia de su determinación, estos compuestos se pueden formar por altas temperaturas o por las condiciones ácidas en las que se realiza la hidrólisis enzimática. Estos compuestos inhibidores, muchas veces están presentes desde la recepción del sustrato, y otros se forman en el hidrolizado enzimático, durante la bioconversión de celulosa por las enzimas celulasas y la hemicelulosa por enzimas xilanasas. La cepa fungí que fue usada para la producción de enzimas hidrolasas que biodegradaron al material lignocelulósico en sus componentes monoméricos, fue el hongo Trichoderma reesei, argumentando por medio de los estudios realizados, este hongo tiene requerimientos como por ejemplo la temperatura óptima de crecimiento oscila entre los 26 a 32 °C y toleran un amplio rango de pH de 2 a 8,5. Este hongo fue inoculado en una solución de carboximetilcelulosa (CMC) al 4 %, por ser el sustrato de la enzima celulasa, a una temperatura de 32 °C por un periodo de tiempo de 24 horas, con la finalidad de adaptar el hongo a las condiciones del proceso. Para realizar el objetivo general que se basa en la cuantificación de los compuestos inhibidores que se forman en el hidrolizado enzimático de la celulosa y hemicelulosa, se procedió a realizar una solubilización de la cáscara al 15 % en agua desionizada, con agitación magnética por 1 hora y seguido de esto se procedió a la toma de muestra y previa medición en el espectrofotómetro UV visible la presencia de nitratos y nitritos. El método usado para determinación de nitratos fue el de diazotación por y para nitritos fue la reducción de cadmio ambos por método de espectrofotometría UV visible. Para la determinación de estos compuestos en el hidrolizado enzimático, se preparó el medio de cultivo, formado por la cáscara de arroz pulverizada y tamizada y agua desionizada, en una concentración de sustrato del 15 % que fue inoculado con conidias del hongo Trichoderma reesei, en concentración de 2 g/L que se incubaron por 72 horas a temperatura ambiente y pH 5,3 – 7, se realizó la toma de 3 muestras en un intervalo de 24 horas entre cada una, luego se procedió a identificar a los compuestos inhibidores que se formaron en el hidrolizado. La determinación de 5-HMF y ácido levulínico, se llevó a cabo por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia, que por sus siglas en ingles es HPLC acoplado a masas. Los compuestos inhibidores encontrados en la cáscara de arroz fueron los nitratos que superaban los mil mg/L y nitritos en menor concentración. Entre los compuestos más influyentes como inhibidores de la hidrólisis enzimática de la celulosa y hemicelulosa de la cáscara de arroz, fueron el 5-HMF y el ácido levulínico.

Descripción:

In the present investigation, a quantification of the inhibitory compounds that were formed in the enzymatic hydrolyzate of the cellulose and hemicellulose present in the rice husk was carried out, an accomplishment of the physical chemistry and the determination of inhibitory compounds The rice husk, in order to know if this lignocellulosic biomass initially contains inhibitory compounds. The inhibitory compounds retard the rate of reaction of the hydrolytic enzymes, which is why the determination of these compounds can even be formed by the high temperatures or by the acidic conditions in which the enzymatic hydrolysis is carried out. These inhibitory compounds are often present upon receipt of the substrate, and others form in the hydrolyzed enzyme, during the bioconversion of cellulose by cellulase enzymes and hemicellulose by xylanase enzymes. The fungus strain that was used for the production of hydrolases enzymes that biodegraded the lignocellulosic material in its monomeric components was the fungus Trichoderma reesei, discussing by means of the studies carried out, this fungus has requirements such as the optimal temperature of oscillating growth Between 26 and 32 ° C and tolerate a wide pH range of 2 to 8.5. This fungus was inoculated in a solution of 4% carboxymethylcellulose (CMC), as the substrate of the cellulase enzyme, at a temperature of 32 ° C for a period of 24 hours, in order to adapt the fungus to the Process conditions. To achieve the general objective that is based on the quantification of the inhibitory compounds that are formed in the enzymatic hydrolyzate of cellulose and hemicellulose, a 15% solubilization of the shell in deionized water was carried out with magnetic stirring for 1 hour And followed by this we proceeded to the sample taking and the previous measurement in the visible UV spectrophotometer the presence of nitrates and nitrites. The method used for the determination of nitrates was the diazotization by and for the nitrites was the reduction of cadmium both by the visible UV spectrophotometry method. For the determination of these compounds in the enzymatic hydrolyzate, the culture medium, consisting of powdered and sifted rice husk and deionized water, was prepared at a substrate concentration of 15% which was inoculated with conidia of the fungus Trichoderma reesei, in Concentration of 2 g / L which were incubated for 72 hours at room temperature and pH 5.3-7, 3 samples were taken in a 24-hour interval between each, then the inhibitory compounds were identified Formed in the hydrolyzate. The determination of 5-HMF and levulinic acid was carried out by High Performance Liquid Chromatography, which is mass-coupled HPLC. The inhibitory compounds found in the rice husk were the nitrates that exceeded the minerals and nitrites in a lower concentration. Among the most influential compounds as inhibitors of the enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose of the rice husk were 5-HMF and levulinic acid.

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